SD大鼠乳鼠原代皮质神经元和小胶质细胞同时提取并培养的实验方法

• Published in: 中国组织工程研究 Vol. 29; no. 7; pp. 1395 - 1400
• Main Authors: 何龙才, 宋文学, 明江, 陈光唐, 王军浩, 廖益东, 崔君拴, 徐卡娅
• Format: Journal Article
• Language: Chinese
• Published: 贵州医科大学,贵州省 贵阳市 550004%贵阳市第一人民医院,贵州省 贵阳市 550002%贵州医科大学附属医院,神经外科,贵州省 贵阳市 550004%贵州医科大学,贵州省 贵阳市 550004 2025; 贵州医科大学附属医院,高压氧科,贵州省 贵阳市 550004; 贵州医科大学附属医院,神经外科,贵州省 贵阳市 550004
• Subjects: cell extraction; primary cortical neuron; microglial cell; 细胞培养; cell culture; SD rat; 原代皮质神经元; SD大鼠; 细胞提取; 小胶质细胞
• ISSN: 2095-4344
• DOI: 10.12307/2025.011

R459.9%R318%R651; 背景:原代皮质神经元和小胶质细胞在探索神经系统疾病细胞疗法中起着至关重要的作用,而目前获得2种细胞的方法大多较繁琐,需分别单独提取.因此找到一种便捷、快速可同时提取2种细胞的方法十分关键. 目的:探索一种新型同时提取原代皮质神经元及小胶质细胞的方法. 方法:取24 h内新生SD大鼠乳鼠,将大脑取出放入装有DMEM的培养皿中,去除软脑膜后备用.同一脑组织,先提取原代神经元,再将剩余脑组织用于提取小胶质细胞,整个过程在冰上操作.原代皮质神经元提取培养步骤:镊子夹取2.0-3.0 mm厚度大脑皮质组织置于培养皿,用木瓜蛋白酶消化20 min,中止消化后吹打组织呈互相粘连的组织悬液,吸上清细胞悬液,过滤、分装到15 mL离心管中,离心并重悬后将细胞接种于左旋多聚赖氨酸包被的6孔板爬片上放入细胞培养箱,每隔1 d观察神经元形态,第7天进行MAP2和β-Tubulin免疫荧光染色鉴定.小胶质细胞提取培养步骤:夹取上一步取皮质后剩余脑组织,厚度8-10 mm,置于培养皿,用胰酶消化20 min,中止消化后吹打组织呈匀浆,然后将匀浆转移到培养瓶中培养,第14天将培养瓶封口后进行恒温水平摇床振荡2 h,小胶质细胞脱落于上清中;取纯化后的小胶质细胞继续培养3 d进行Iba1免疫荧光染色鉴定. 结果与结论:①神经元培养24 h后贴壁、胞体变大,部分神经元长出突触;培养到第3,5天时胞体进一步增大,大部分神经元已呈突触形态,部分神经元成团生长;第7天时,神经元突触延长增粗并互相连接成网.经β-Tubulin、MAP2免疫荧光染色鉴定为神经元.②小胶质细胞培养第1天换液后可见细胞贴壁生长;第3,5,7天时细胞密度均较小,细胞形态呈高亮椭圆或圆形,但已基本成团块状生长于其他细胞上层;第10天时小胶质细胞密度明显增大;第14天时小胶质细胞呈致密团块状生长于其他细胞上层,此时可进行分离纯化.取分离纯化后细胞再培养至第3天,经Iba1免疫荧光鉴定为小胶质细胞,且纯度大于95%.③结果表明,经此法提取并培养获得的原代皮质神经元和小胶质细胞纯度高、形态好、成活率高.