麻鸭磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶高效可溶性表达及其部分酶学性质

S843.83; [目的]克隆麻鸭磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因(GPx4)并在大肠杆菌中表达,分析其酶学特性,为研究GPx4功能及其在羟基脂肪酸形成过程中的调节机制打下基础.[方法]采用RT-PCR克隆麻鸭GPx4(DGPx4)的编码基因,利用定点突变的方法构建半胱氨酸突变体DGPx4表达载体pMBP-DGPx4(48Sec→Cys),并在大肠杆菌中通过添加His标签进行可溶性表达,经Ni-NTA亲和层析和离子交换层析纯化得到融合蛋白DGPx4;采用总谷胱甘肽过氧化物酶活性检测试剂盒检测DGPx4活力以研究其酶学性质.[结果]克隆获得的DGPx4基因编码序列全长516 bp,编码172个氨基酸...

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Published in南方农业学报 Vol. 50; no. 5; pp. 1120 - 1126
Main Authors 王晶晶, 张新笑, 卞欢, 耿志明, 李鹏鹏, 王道营, 徐为民
Format Journal Article
LanguageChinese
Published 江苏省农业科学院农产品加工研究所,南京 210014 2019
南京农业大学肉品加工与质量控制教育部重点实验室,南京 210095%江苏省农业科学院农产品加工研究所,南京,210014%江苏省农业科学院农产品加工研究所,南京 210014
江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心,南京 210095
Subjects
麻鸭
酶学性质
原核表达
磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(GPx4)
纯化
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ISSN2095-1191
DOI10.3969/j.issn.2095-1191.2019.05.28

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Summary:S843.83; [目的]克隆麻鸭磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因(GPx4)并在大肠杆菌中表达,分析其酶学特性,为研究GPx4功能及其在羟基脂肪酸形成过程中的调节机制打下基础.[方法]采用RT-PCR克隆麻鸭GPx4(DGPx4)的编码基因,利用定点突变的方法构建半胱氨酸突变体DGPx4表达载体pMBP-DGPx4(48Sec→Cys),并在大肠杆菌中通过添加His标签进行可溶性表达,经Ni-NTA亲和层析和离子交换层析纯化得到融合蛋白DGPx4;采用总谷胱甘肽过氧化物酶活性检测试剂盒检测DGPx4活力以研究其酶学性质.[结果]克隆获得的DGPx4基因编码序列全长516 bp,编码172个氨基酸,编码蛋白分子量约20 kD,理论等电点(pI)为8.9.构建的突变体基因原核表达载体pMBP-DGPx4(48Sec→Cys)可在大肠杆菌中成功诱导表达获得融合蛋白DGPx4,经Ni-NTA亲和层析和离子交换层析即获得高纯度的DG-Px4.以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)为底物时,DGPx4的最适反应温度为32℃,最适pH为8.0,对NaCl浓度较敏感;Cu2+和Ni2+对DGPx4活力有较高的促进作用,Mg2+和Mn2+对DGPx4活力有一定的抑制作用,Ca2+和Zn2+对DG-Px4活力则无明显的促进或抑制作用.[结论]从鸭肝细胞中克隆获得的DGPx4基因序列经定点突变后可在原核细胞中高效表达,且纯化后的高纯度融合蛋白DGPx4具有GPx4活力,能在抗脂质氧化过程中发挥作用.
ISSN:2095-1191
DOI:10.3969/j.issn.2095-1191.2019.05.28