Rb荧光素酶报告基因检测系统构建及检测能力评估

Q33; 目的 构建Rb荧光素酶报告基因检测系统并检测Rb基因的活化和抑制水平,为多种肿瘤的靶向治疗药物筛选提供实验基础.方法 通过双酶切将人工合成的Rb反应原件基因序列连接到报告基因载体pGL6-TA的多克隆位点区,并转化E.coli DH5α感受态细胞构建载体pGL6-Rb-Luc.将基因测序序列正确的pGL6-Rb-Luc质粒和对照pGL6-TA质粒分别转染人肾上皮细胞系HEK293,通过抗性基因筛选,可获得稳定表达Rb荧光素酶报告基因的HEK293-Rb-Luc单克隆细胞株和对照细胞株,再分别通过血清刺激和CDK4/6抑制剂Palbociclib来检测报告基因检测系统HEK293-Rb...

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Published in西安交通大学学报（医学版） Vol. 42; no. 3; pp. 463 - 467
Main Authors 王博, 杨泽健, 张妙, 田碧霞, 宋少苒, 孙伟, 高小倩, 周灿, 刘培军
Format Journal Article
LanguageChinese
Published 陕西省肿瘤精准医学重点实验室,陕西西安 710061%西安交通大学第一附属医院转化医学中心,陕西西安 710061 05.05.2021
西安交通大学第一附属医院乳腺外科,陕西西安 710061%西安交通大学第一附属医院乳腺外科,陕西西安 710061
西安交通大学第一附属医院转化医学中心,陕西西安 710061
Subjects
Rb
活性检测
荧光素酶
报告基因
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ISSN1671-8259
DOI10.7652/jdyxb202103025

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Summary:Q33; 目的 构建Rb荧光素酶报告基因检测系统并检测Rb基因的活化和抑制水平,为多种肿瘤的靶向治疗药物筛选提供实验基础.方法 通过双酶切将人工合成的Rb反应原件基因序列连接到报告基因载体pGL6-TA的多克隆位点区,并转化E.coli DH5α感受态细胞构建载体pGL6-Rb-Luc.将基因测序序列正确的pGL6-Rb-Luc质粒和对照pGL6-TA质粒分别转染人肾上皮细胞系HEK293,通过抗性基因筛选,可获得稳定表达Rb荧光素酶报告基因的HEK293-Rb-Luc单克隆细胞株和对照细胞株,再分别通过血清刺激和CDK4/6抑制剂Palbociclib来检测报告基因检测系统HEK293-Rb-Luc的激活作用以及抑制作用.结果 分析载体的测序结果并进行比对,确定构建的载体pGL6-Rb-Luc中Rb反应元件基因序列已正确插入载体多克隆位点区.HEK293-Rb-Luc细胞株经无血清培养同步后,恢复血清培养6、12、24 h细胞中荧光素酶的活性均显著升高(P<0.001),对照细胞未发生显著变化.相比于0 nmol/L Palbociclib组,25、50、75、100 nmol/L的CDK4/6抑制剂Palbociclib使Rb活性的抑制率分别达6.90％、40.23％、50.57％、52.07％(P<0.05).结论 已成功构建并筛选出Rb荧光素酶报告基因检测系统HEK293-Rb-Luc且能够有效地检测Rb的活化水平.
ISSN:1671-8259
DOI:10.7652/jdyxb202103025