Taq DNA聚合酶的分子改造及其在探针法qPCR直扩体系中的应用

Q814; Taq DNA聚合酶作为实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)技术的核心组分,其性能优劣直接影响qPCR技术的进一步发展.然而,野生型Taq DNA聚合酶的耐抑制剂性能差、延伸性能不足.为获得具有高性能的Taq DNA聚合酶,采用基因工程技术将双链DNA结合蛋白Sso7d或Sto7d融合在野生型Taq DNA聚合酶的N端或C端,构建了4个均可溶表达的改造体,再经过耐受性测试筛选较优的改造体,结果显示:改造体Taq-Sto的耐受性最高,其热稳定性不受影响,且在1 s/kbp的延伸条件下能成功扩增靶标,表明Taq-Sto具有增强的延伸性能,在TaqMan探针法qPCR体系中对腐殖酸、单...

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Published in华南理工大学学报（自然科学版） Vol. 52; no. 4; pp. 8 - 16
Main Authors 胡松青, 袁家惠, 刘光毅, 侯轶
Format Journal Article
LanguageChinese
Published 广州英赞生物科技有限公司,广东 广州 510555%华南理工大学 轻工科学与工程学院,广东 广州 510640 01.04.2024
华南理工大学 食品科学与工程学院,广东 广州 510640%华南理工大学 食品科学与工程学院,广东 广州 510640
Subjects
double-stranded DNA-binding protein
聚合酶链式反应
双链DNA结合蛋白
耐受性
tolerance
polymerase chain reaction
Taq DNA聚合酶
Taq DNA polymerase
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ISSN1000-565X
DOI10.12141/j.issn.1000-565X.230090

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Summary:Q814; Taq DNA聚合酶作为实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)技术的核心组分,其性能优劣直接影响qPCR技术的进一步发展.然而,野生型Taq DNA聚合酶的耐抑制剂性能差、延伸性能不足.为获得具有高性能的Taq DNA聚合酶,采用基因工程技术将双链DNA结合蛋白Sso7d或Sto7d融合在野生型Taq DNA聚合酶的N端或C端,构建了4个均可溶表达的改造体,再经过耐受性测试筛选较优的改造体,结果显示:改造体Taq-Sto的耐受性最高,其热稳定性不受影响,且在1 s/kbp的延伸条件下能成功扩增靶标,表明Taq-Sto具有增强的延伸性能,在TaqMan探针法qPCR体系中对腐殖酸、单宁酸、全血等抑制剂同样表现出良好的耐受性.EMSA实验发现:Taq-Sto对DNA模板的结合亲和力有所提高,有利于增强Taq-Sto对模板的竞争力;将Taq-Sto应用于非洲猪瘟病毒(ASFV)的TaqMan探针法qPCR检测,与商品化试剂相比,Taq-Sto具有更低的ASFV检出限,且在体积分数为2%～6%的猪粪便样本或猪肉样本中的检测灵敏度分别为100.0%和85.4%,说明Taq-Sto在直扩qPCR检测领域更具有优势.
ISSN:1000-565X
DOI:10.12141/j.issn.1000-565X.230090