基于微滴数字PCR技术建立HBV共价闭合环状DNA的检测方法

• Published in: Linchuang gandanbing zazhi Vol. 37; no. 8; pp. 1806 - 1810
• Main Authors: 田原, 徐玲, 范子豪, 曹亚玲, 张向颖, 陈煜, 段钟平, 任锋
• Format: Journal Article
• Language: Chinese
• Published: Changchun Journal of Clinical Hepatology 01.08.2021; 首都医科大学附属北京佑安医院,北京市肝病研究所,北京100069%首都医科大学附属北京佑安医院肝病中心四科,肝衰竭与人工肝治疗研究北京市重点实验室,北京100069
• Subjects: Hepatitis B; 微滴数字PCR; DNA,环状; 乙型肝炎病毒
• ISSN: 1001-5256; 2097-3497
• DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2021.08.013

目的 建立一种用于检测HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)的微滴数字PCR(ddPCR)方法。 方法 构建HBV cccDNA标准品，利用HBV cccDNA和松弛环状DNA(rcDNA)在结构上存在的差异，设计HBV cccDNA引物和探针，通过扩增HBV质粒得到HBV cccDNA标准品，把梯度稀释后的标准品作为HBV cccDNA检测的模板，建立ddPCR检测方法，并分析此方法的检出限和重复性；收集2017年6月—2020年10月在首都医科大学附属北京佑安医院就诊的20例临床患者的肝组织样本，均诊断为HBV感染，提取样本的DNA，利用质粒安全性ATP依赖的DNA酶(PSAD)进行酶切，得到HBV cccDNA模板，对ddPCR检测方法进行临床样本的评价，并与实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法作对比。计数资料两组间比较采用χ2检验。 结果 建立了基于ddPCR的HBV cccDNA检测方法，梯度稀释的HBV cccDNA标准品均能准确检出，检出限为1拷贝/μl，其中1×103、1×102、1×101拷贝/μl标准品的变异系数分别为4.41%、3.98%、5.09%；检测20例临床HBV患者样本的HBV cccDNA，ddPCR检测方法能检出17例，阳性率为85%，qPCR检测方法能检出11例，阳性率为55%，两组比较差异有统计学意义(χ2=4.286，P=0.038)。 结论 建立的ddPCR检测HBV cccDNA方法具有较低的检出限和较好的重复性，为进一步的临床检测提供了有效的工具。