B형 간염바이러스 중합효소의 역전사효소 활성을 억제하는 인간 단세포군 항체

• Published in: The Korean journal of gastroenterology Vol. 49; no. 2; pp. 85 - 92
• Main Authors: 박성재, Sung Jae Park, 설상영, Sang Yong Seol, 지삼룡, Sam Ryong Jee, 박은택, Eun Taik Park, 이연재, Youn Jae Lee, 이상혁, Sang Hyuk Lee, 정정명, Jung Myung Chung, 조현대, Hyun Dae Cho, 정영주, Young Ju Jeong, 최인학, In Hak Choi, 박세광, Sae Gwan
• Format: Journal Article
• Language: Korean
• Published: 대한소화기학회 28.02.2007
• Subjects: B형 간염바이러스; Hepatitis B virus; Human monoclonal antibody; Phage display; Reverse transcriptase; 내과학; 역전사효소; 인간 단세포군 항체; 파지 디스플레이
• ISSN: 1598-9992; 2233-6869

목적: 간경변과 간암의 주 원인 중 하나인 B형 간염바이러스(hepatitis B virus, HBV)에 대한 새로운 치료법의 개발의 일환으로 phage display 기법을 이용하여 바이러스 복제에 있어 중요한 P 단백의 역전사효소 활성을 억제하는 인간 단세포군 항체를 제작하여 protein based 유전자 치료 가능성을 분석하고자 하였다. 대상 및 방법: HBV P 단백의 역전사효소 기능 부위인 RT/POL 기능 부위를 pMAL-C 벡터에 클로닝하고 maltose binding protein과 융합 단백의 형태로 재조합 단백으로 발현시켰다. 1.1×10(10)의 인체 single chain Fv phage antibody library를 사용하여 RT/POL 재조합 단백에 대한 항체를 BIAcore로 선택하였다. 선택된 항체의 역전사효소, RNA-dependent DNA 중합효소 기능 정도를 분석하였으며 BIAcore로 항원에 대한 친화도를 그리고 염기서열 분석을 통하여 항원 결정 부위를 확인하였다. 결과: 대장균에서 발현 정제된 RT/POL 기능 부위 재조합 단백은 역전사효소 활성을 유지하고 있었으며, 1μg의 재조합 단백은 5 unit의 MMLV 역전사효소와 동일한 효소 활성을 가지고 있었다. BIAcore를 이용한 RT/POL에 대한 항체의 선택으로 POL-A5, POL-B8 그리고 POL-B12의 3개 클론을 확보하였다. 선택된 클론들의 역전사효소 활성 억제능은 각각 82- 52%였으며, 항원에 대한 친화도는 8.15×10(-8) M to 1.75×10(-6) M이었다. 결론: 이번 연구를 통하여 제작된 인간 단세포군 항체는 항원에 대한 친화도가 낮았으나 in vitro에서 효과적으로 역전사효소 활성을 억제하여 protein based gene therapy로서 세포 내 항체로 발현한다면 HBV P 단백의 기능을 억제하여 바이러스의 복제를 억제할 것이다. Background/Aims: To develop a novel treatment method for hepatitis B virus (HBV) infection, we aimed to make a human monoclonal antibody inhibiting reverse transcriptase (RT) activity of P protein which was important in HBV replication by using phage display technique. Therefore, we analysed the usability of human monoclonal antibody as a protein based gene therapy. Methods: Reverse transcriptase/polymerase (RT/POL) functional motif of P protein of HBV was cloned in pMAL-c vector and expressed as maltose binding fusion protein form. The RT/POL recombinant protein (pMRT/POL) was purified by amylose resin column. Using human single chain Fv phage antibody library with 1.1×10(10) size, human antibody against pMRT/POL was selected with BIAcore panning. Selected antibody fragments were analyzed for the activity of RT inhibition. Finally, they were analyzed for the affinity with BIAcore and the complementarity determining regions with nucleotide sequencing. Results: pMRT/POL recombinant protein expressed in E. coli showed RT activity, 1㎍ of recombinant protein had an activity equivalent to 5 unit of MMLV RT. By BIAcore panning, we could select 3 clones; POL-A5, POL-B8 and POL-B12. Each clone`s RT inhibiting activity were 52-82%, affinity against antigen were 8.15×10(-8) M to 1.75×10(-6) M. Conclusions: Human monoclonal antibodies produced in this study showed low affinity, but efficiently inhibited the activity of RT in vitro. If POL-A5, POL-B8, and POL-B12 can be converted to intracellular antibody form, it can be used for protein-based gene therapy by inhibiting the replication through the neutralization of polymerase protein of HBV. (Korean J Gastroenterol 2007;49:85-92)