The influence of amplicon length on real-time PCR results

• Published in: Biotechnologie, agronomie, société et environnement Vol. 21; no. 1; pp. 3 - 11
• Main Authors: Debode, F., Marien, A., Janssen, E., Bragard, C., Berben, G.
• Format: Journal Article
• Language: English
• Published: Université de Liège 01.01.2017; Presses Agronomiques de Gembloux
• Subjects: amorce; amplicon size; GMO; OGM; PCR en temps réel; primers; probes; real-time PCR; sondes; SYBR® Green; taille des amplicons
• ISSN: 1370-6233; 1780-4507
• DOI: 10.25518/1780-4507.13461

Description of the subject. This paper discusses the influence of amplicon length on real-time PCR results.Objectives. The aim of the experiments was to show that amplicon size has an influence on detection.Method. Tests were performed on genomic and plasmid DNA. Double-dye probes and SYBR® Green were used for detection by real-time PCR. Primers were selected in order to produce fragments with increasing sizes. Experiments dealt with two targets: an endogenous target for soybean (part of the lectin gene) and a transgenic target (junction P35S-CTP of the MON40-3-2 soybean).Results. The results show that the kinetics of amplification curves evolve as a function of amplicon length, and smaller amplicons yield a higher level of fluorescence for the plateau phase. DNA degradation within the sample as well as the principles of fluorescence acquisition as a function of the chemistry used can also be factors. Conclusions. It was experimentally shown that the observed effect is linked to the suboptimal elongation temperature used in real-time PCR. Detection using SYBR® Green is less impacted as the loss of efficiency is partially compensated by the greater integration of SYBR® Green molecules in the larger fragments. Influence de la taille de l’amplicon sur les résultats obtenus par PCR en temps réelDescription du sujet. Cet article traite de l’influence de la taille de l’amplicon sur les résultats obtenus par PCR en temps réel.Objectifs. Le but des expériences menées vise à montrer que la taille de la région ciblée a une influence sur la détection.Méthode. Les expériences ont été réalisées sur de l’ADN génomique et plasmidique. Les techniques d’amplification par PCR en temps réel ont été effectuées soit au moyen de sondes d’hybridation ou de SYBR® Green. Des amorces ont été sélectionnées de manière à produire des fragments de tailles croissantes. Les expériences ont été réalisées sur deux cibles : une cible endogène au soja (portion du gène de la lectine) et une cible transgénique (jonction P35S-CTP de la construction du soja MON40-3-2).Résultats. Les résultats ont montré que la cinétique d’amplification évolue en fonction de la taille de l’amplicon et que les plus petits amplicons atteignent un plus haut niveau de fluorescence en phase plateau. L’utilisation d’un ADN dégradé ainsi que la chimie utilisée ont un impact sur les résultats.Conclusions. Il a été démontré expérimentalement que l’effet observé est lié à la température d’élongation suboptimale utilisée en PCR en temps réel. Le format de PCR utilisant le SYBR® Green est cependant moins impacté car la perte d’efficience est partiellement compensée par l’intégration d’un nombre de molécules de SYBR® Green plus important dans les plus grands fragments.