嗜酸乳杆菌GGDEF和EAL结构域相关蛋白的表达、纯化及活性分析

• Published in: 南方医科大学学报 Vol. 37; no. 5; pp. 633 - 639
• Main Author: 何嘉辉 孙洁丽 闫文娟 王方
• Format: Journal Article
• Language: Chinese
• Published: 南方医科大学南方医院口腔科,广东广州,510515%南方医科大学基础医学院神经生物学教研室,广东广州,510515 2017
• Subjects: 嗜酸乳杆菌;环二鸟苷酸;GGDEF结构域;EAL结构域;酶活性检测;高效液相色谱; 嗜酸乳杆菌; 酶活性检测; c-di-GMP; EAL结构域; 环二鸟苷酸; EAL domain; GGDEF结构域; high-performance liquid chromatography; 高效液相色谱; Lactobacillus acidophilus; GGDEF domain; enzymatic activity assays
• ISSN: 1673-4254
• DOI: 10.3969/j.issn.1673-4254.2017.05.11

目的 鉴定嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）中含GGDEF和EAL结构域相关蛋白的功能。为进一步研究环二鸟苷酸（c-di-GMP）在该菌株中的调控机制奠定基础。方法 从嗜酸乳杆菌ATCC4356基因组中PCR扩增出NH1307045-GGDEF、NH1307050和NH1307055这3个基因片段,分别构建其重组表达质粒。经鉴定后,转入大肠杆菌表达宿主中,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组蛋白,经直链淀粉树脂纯化后进行体外酶活性实验,再通过高效液相色谱检测反应产物。结果 通过PCR扩增的目的 基因片段经重组质粒双酶切后其大小与预期相符,测序结果 与Gen Bank中嗜酸乳杆菌ATCC4356基因序列一致,表明重组质粒构建成功。SDS-PAGE和Western Blot检测表达的重组蛋白相对分子质量分别约为59000（含GGDEF结构域）、67000（含EAL结构域）和72000（含EAL结构域）,与预期大小吻合。经树脂亲和柱纯化及浓缩获得目的 蛋白。高效液相色谱分析结果 显示,NH1307045-GGDEF的表达产物体外无明显双鸟苷酸环化酶（DGC）活性,NH1307050的表达产物体外具有磷酸二酯酶（PDE）活性,而NH1307055的表达产物在体外无明显PDE活性。结论 在本研究的3种基因中,NH1307050的表达产物在体外具有磷酸二酯酶（PDE）的活性。为研究环二鸟苷酸在嗜酸乳杆菌中的调控机制提供了实验依据。