ANG-1基因重组腺相关病毒获取及转染猪骨髓干细胞的研究

R654.2; 目的:构建携带血管形成素-1(ANG-1)基因腺相关病毒(AAV)载体,通过病毒包装和纯化及滴定,获得高纯度高感染性的病毒液,并转染到乳猪骨髓干细胞中,获得有效表达,为进行血管再生的基因治疗研究奠定基础.方法:利用PCR技术,获取目的基因ANG-1,通过重组DNA技术得到ANG-1与pUC119的重组质粒,采用SalⅠ和BglⅡ双酶将pUC119中的目的基因ANG-1基因片断切出,再克隆到质粒pSNAV2.0中.用Lipofectamine将pSNAV ANG-1质粒转染293细胞后,用G418选择培养获得293/AAV2ANG-1细胞株,产生了有传染性的病毒颗粒,纯化并进行病...

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Published in浙江大学学报（医学版） Vol. 38; no. 4; pp. 370 - 376
Main Authors 朱成楚, 陈仕林, 刘玉清, 唐礼江, 包卫光
Format Journal Article
LanguageChinese
Published 浙江省台州医院心胸外科,浙江,临海,317000%江苏省肿瘤医院胸外科,江苏,南京,210000%阜外医院临床心血管药理中心,北京,100037 2009
Subjects
血管生成素1/代谢
Adenoviridae/genet
骨髓干细胞
Angiopoietin-1/metab
腺相关病毒载体
骨髓祖代细胞/代谢
rAAV
腺病毒科/遗传学
Myeloid progenitor cells/metab
Transfection
重组,遗传
转染
Recombination,genetic
Mesenchymal stem cells
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ISSN1008-9292
DOI10.3785/j.issn.1008-9292.2009.04.008

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Summary:R654.2; 目的:构建携带血管形成素-1(ANG-1)基因腺相关病毒(AAV)载体,通过病毒包装和纯化及滴定,获得高纯度高感染性的病毒液,并转染到乳猪骨髓干细胞中,获得有效表达,为进行血管再生的基因治疗研究奠定基础.方法:利用PCR技术,获取目的基因ANG-1,通过重组DNA技术得到ANG-1与pUC119的重组质粒,采用SalⅠ和BglⅡ双酶将pUC119中的目的基因ANG-1基因片断切出,再克隆到质粒pSNAV2.0中.用Lipofectamine将pSNAV ANG-1质粒转染293细胞后,用G418选择培养获得293/AAV2ANG-1细胞株,产生了有传染性的病毒颗粒,纯化并进行病毒DNA颗粒滴度测定.分别将绿色荧光蛋白(GFP)基因重组腺相关病毒(rAAV2GFP)及rAAV2ANG-1感染猪骨髓干细胞,并对转染效率及转染后表达情况进行初步研究.结果:测序证实ANG-1与GenBank提供的原始序列完全一致.重组载体经酶切鉴定与PCR筛选证实重组质粒和预期结果完全一致,在新的重组质粒中,ANG-1有一套CMV启动子和PolyA终止子系统.293细胞包装病毒效果良好,携带ANG-1的感染性AAV滴度为9×1011v.g/ml,用Western杂交法检测显示猪骨髓干细胞中表达ANG-1.1×106v.g/ml rAAV2GFP感染CD34阳性细胞48h后55%左右的细胞有明显的荧光.结论:ANG-1基因AAV构建成功,并能在骨髓干细胞中有效表达,为严重缺血性疾病基因治疗的研究奠定了基础.
ISSN:1008-9292
DOI:10.3785/j.issn.1008-9292.2009.04.008