低氧诱导因子基因重组腺病毒载体的构建及其在内皮细胞中的表达

Q78; 目的:构建携带低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的腺病毒载体(pAdxsi-GFP-HIF),观察其在内皮细胞中的表达.方法:低氧处理A549细胞后提取总RNA并逆转录为cDNA,以之作为模板,依据基因库公布的HIF-1 αcDNA设计引物,分别引入KpnI和BamHI酶切位点,PCR扩增后将目的基因HIF-1α连接到载体pShuttle-CMV-EGFP上,构建穿梭质粒pShuttle-GFP-HIF.采用细菌内重组方法将目的序列重组到pAdxsi病毒骨架载体上构建携带HIF-1α基因的重组腺病毒载体.检测重组腺病毒效价后,转染人脐静脉内皮细胞ECV304,检测目的基因的转染表...

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Published in浙江大学学报（医学版） Vol. 42; no. 6; pp. 654 - 659
Main Authors 哈小琴, 姜东红, 邓芝云, 董菊子, 赵勇, 彭俊华, 杨志华
Format Journal Article
LanguageChinese
Published 兰州军区兰州总医院检验医学中心,甘肃省干细胞与基因药物重点实验室,甘肃兰州730050 2013
Subjects
Genetic vectors
重组,遗传
遗传载体
基因表达
Recombination,genetic
低氧诱导因子-1α
内皮细胞
Gene expression
Endothelial cells
Hypoxia inducible factor 1 α
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ISSN1008-9292
DOI10.3785/j.issn.1008-9292.2013.06.011

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Summary:Q78; 目的:构建携带低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的腺病毒载体(pAdxsi-GFP-HIF),观察其在内皮细胞中的表达.方法:低氧处理A549细胞后提取总RNA并逆转录为cDNA,以之作为模板,依据基因库公布的HIF-1 αcDNA设计引物,分别引入KpnI和BamHI酶切位点,PCR扩增后将目的基因HIF-1α连接到载体pShuttle-CMV-EGFP上,构建穿梭质粒pShuttle-GFP-HIF.采用细菌内重组方法将目的序列重组到pAdxsi病毒骨架载体上构建携带HIF-1α基因的重组腺病毒载体.检测重组腺病毒效价后,转染人脐静脉内皮细胞ECV304,检测目的基因的转染表达.结果:通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带HIF-1α基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF构建成功,且构建的重组腺病毒纯度好、效价高.以100 MOI转染ECV304细胞24 h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,转染48 h时荧光表达更强,且培养上清液中HIF-1蛋白表达水平为(48.93±3.86) ng/mL.结论:本实验构建的携带HIF-1α基因的腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF转染效率及目的基因的蛋白表达水平均较高,有望应用于缺血缺氧组织局部.
ISSN:1008-9292
DOI:10.3785/j.issn.1008-9292.2013.06.011