重组人细胞角蛋白9 cDNA的原核表达及纯化

目的 克隆人细胞角蛋白CK9的cDNA,通过原核表达系统表达融合蛋白并进行纯化和鉴定。方法 从人角质形成细胞系（HaCaT）中提取RNA,以RT-PCR反转录cDNA,使用特异性引物PCR扩增出人CK9编码区全长并克隆到pET-28a载体上,再用IPTG诱导融合蛋白his-CK9的表达。表达的融合蛋白通过Ni 2＋亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果 测序鉴定构建表达载体中CK9的cDNA序列正确;融合蛋白his-CK9可在大肠杆菌中诱导表达;纯化的融合蛋白his-CK9纯度较高;纯化的融合蛋白his-CK9可与商品化CK9抗体特异性结合。结论 成功构建原核...

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Published in西安交通大学学报（医学版） Vol. 38; no. 4; pp. 502 - 506
Main Author 王博 周艳 侯卫坤 蔡永松 张英 王林玉 韩燕 孟列素
Format Journal Article
LanguageChinese
Published 西安交通大学第一附属医院转化医学中心,陕西西安710061 2017
西安交通大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学系,陕西西安710061
陕西省肿瘤精准医学重点实验室%西安交通大学第一附属医院皮肤科,陕西西安,710061%西安交通大学医学部附属红会医院骨坏死与关节重建病区,陕西西安,710054%西安交通大学第一附属医院骨科,陕西西安,710061%西安交通大学第一附属医院消化内科,陕西西安,710061%西安交通大学第一附属医院转化医学中心,陕西西安710061
陕西省肿瘤精准医学重点实验室%西安交通大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学系,陕西西安,710061
Subjects
原核表达系统
细胞角蛋白9
细胞骨架
融合蛋白
细胞骨架
fusion protein
prokaryotic expression system
cytokeratin 9
cytoskeleton
融合蛋白
细胞角蛋白9
原核表达系统
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ISSN1671-8259
DOI10.7652/jdyxb201704007

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Summary:目的 克隆人细胞角蛋白CK9的cDNA,通过原核表达系统表达融合蛋白并进行纯化和鉴定。方法 从人角质形成细胞系（HaCaT）中提取RNA,以RT-PCR反转录cDNA,使用特异性引物PCR扩增出人CK9编码区全长并克隆到pET-28a载体上,再用IPTG诱导融合蛋白his-CK9的表达。表达的融合蛋白通过Ni 2＋亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果 测序鉴定构建表达载体中CK9的cDNA序列正确;融合蛋白his-CK9可在大肠杆菌中诱导表达;纯化的融合蛋白his-CK9纯度较高;纯化的融合蛋白his-CK9可与商品化CK9抗体特异性结合。结论 成功构建原核表达载体pET-28a-CK9,并成功诱导及纯化融合蛋白his-CK9。
Bibliography:Objective To clone and fuse the cDNA of human cytokeratin 9 in prokaryotic expression system, and purify and identify the fusion protein. Methods The cDNA fragment of human cytokeratin 9 was amplified from human keratinocyte （HaCaT） total RNA with specific primers. The PCR products were cloned into vector pET-28a, then the fusion protein of his-CK9 was induced by IPTG. The expressed fusion protein of his-CK9 was purified by nickel ion affinity chromatography and identified by SDS-PAGE and Western blot. Results Thesequencing proved that the recombinant vector of the cDNA of CK9 was correct. The fusion protein of his-CK9 was induced to be expressed in E. coli. The fusion protein of his-CK9 was highly purified and his-CK9 showed specific binding to the commercialized antibodies of CKg. Conclusion The recombinant vector of pET-28a-CK9 has been successfully constructed, and the fusion protein of his-CK9 has been successfully expressed and purified.
WANG Bo1,2,3, ZHOU Yan4 , HOU Wei-kun5 , CAI Yong-song6 , ZHANG Yin
ISSN:1671-8259
DOI:10.7652/jdyxb201704007