鸡载脂蛋白A-Ⅰ的多克隆抗体制备及亚细胞定位分析 - 王圣文; 张丹; 邬雨倩; 周继勇; 郑肖娟 (浙江大学学报（农业与生命科学版）, 2024)
S855.3; 载脂蛋白A-Ⅰ(apolipoprotein A-Ⅰ,Apo A-Ⅰ)在动脉粥样硬化、病毒感染、脂质代谢等方面发挥重要的调控作用.目前关于鸡载脂蛋白A-Ⅰ(chicken Apo A-Ⅰ,chApo A-Ⅰ)的研究较少,对其生物学功能尚不清楚.本研究在对chApo A-Ⅰ进行生物信息学分析的基础上,通过pET-28a原核表达系统对chApo A-Ⅰ的重组蛋白进行表达和纯化.利用纯化后的重组蛋白免疫小鼠,制备鼠多克隆抗血清(多抗血清),通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测其效价,并通过蛋白质印迹法(Western blot,WB)、间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)鉴定其反应性,随后利用多抗血清对chApo A-Ⅰ进行亚细胞定位分析.生物信息学分析显示,chApo A-Ⅰ蛋白在第1-18位氨基酸处含有信号肽,由N端的连续α螺旋构成.氨基酸序列同源性分析显示,chApo A-Ⅰ蛋白与火鸡的同源性最高,与鱼类的同源性最低.利用成功表达和纯化的重组蛋白His-chApo A-Ⅰ制备多抗血清,其ELISA效价达1×105以上,与真核表达的chApo A-Ⅰ蛋白有WB和IFA反应性,能识别鸡血清中的Apo A-Ⅰ蛋白,而与鼠、兔、牛、猪血清中的Apo A-Ⅰ蛋白无交叉反应性.利用该多克隆抗体对全长片段chApo A-Ⅰ-FL和不含信号肽的片段chApo A-Ⅰ-NS进行亚细胞定位分析,经共聚焦显微镜观察发现,chApo A-Ⅰ-FL蛋白大多分布在细胞膜附近,而chApo A-Ⅰ-NS蛋白则定位于细胞胞浆中,且多数呈弥散分布.chApo A-Ⅰ蛋白的特异性多克隆抗体和亚细胞定位结果为进一步开展Apo A-Ⅰ的生物学功能研究奠定了基础.