一株新型大口黑鲈双RNA病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用

S941.4; 为有效预防大口黑鲈双RNA病毒(largemouth bass birnavirus,LBBV),实验针对LBBV保守基因VP1设计特异性引物,构建重组质粒pMD-LBBV-VP1,通过优化PCR反应条件,提高检测方法的灵敏度和特异性,建立了大口黑鲈双RNA病毒的巢式RT-PCR检测方法,并采用该方法对实验室2017—2020年收集的304株样本进行检测.结果显示,巢氏引物F1/R1、F2/R2最佳工作浓度均为4×10?12 mol,最佳退火温度分别为64.1°C和61.5°C,当巢氏RT-PCR扩增35个循环时,可以检测质粒最低浓度为4.15个/μL拷贝数,最低模拟样品浓度为...

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Published in水产学报 Vol. 45; no. 9; pp. 1584 - 1591
Main Authors 罗明菊, 李宁求, 林强, 牛银杰, 刘礼辉, 梁红茹, 罗霞, 付小哲
Format Journal Article
LanguageChinese
Published 中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业农村部渔用药物创制重点实验室,广东省水产动物免疫技术重点实验室,广东 广州 510380%中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业农村部渔用药物创制重点实验室,广东省水产动物免疫技术重点实验室,广东 广州 510380 01.09.2021
上海海洋大学水产与生命学院,上海 201306
Subjects
大口黑鲈;双RNA病毒;巢式RT-PCR;检测方法
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ISSN1000-0615
DOI10.11964/jfc.20201112480

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Abstract S941.4; 为有效预防大口黑鲈双RNA病毒(largemouth bass birnavirus,LBBV),实验针对LBBV保守基因VP1设计特异性引物,构建重组质粒pMD-LBBV-VP1,通过优化PCR反应条件,提高检测方法的灵敏度和特异性,建立了大口黑鲈双RNA病毒的巢式RT-PCR检测方法,并采用该方法对实验室2017—2020年收集的304株样本进行检测.结果显示,巢氏引物F1/R1、F2/R2最佳工作浓度均为4×10?12 mol,最佳退火温度分别为64.1°C和61.5°C,当巢氏RT-PCR扩增35个循环时,可以检测质粒最低浓度为4.15个/μL拷贝数,最低模拟样品浓度为102 PFU/mL,与第1轮PCR相比,灵敏度均提高了10000倍,同时检测9种不同病毒,仅LBBV出现明亮特异性条带,在304个样品中,第1轮PCR检出阳性样品14株,检出率为4.60％,巢式RT-PCR检出阳性样品28株,检出率为9.21％;本实验建立的巢式RT-PCR检测方法灵敏度高且特异性好,可用于LBBV的早期检测及防控.
AbstractList S941.4; 为有效预防大口黑鲈双RNA病毒(largemouth bass birnavirus,LBBV),实验针对LBBV保守基因VP1设计特异性引物,构建重组质粒pMD-LBBV-VP1,通过优化PCR反应条件,提高检测方法的灵敏度和特异性,建立了大口黑鲈双RNA病毒的巢式RT-PCR检测方法,并采用该方法对实验室2017—2020年收集的304株样本进行检测.结果显示,巢氏引物F1/R1、F2/R2最佳工作浓度均为4×10?12 mol,最佳退火温度分别为64.1°C和61.5°C,当巢氏RT-PCR扩增35个循环时,可以检测质粒最低浓度为4.15个/μL拷贝数,最低模拟样品浓度为102 PFU/mL,与第1轮PCR相比,灵敏度均提高了10000倍,同时检测9种不同病毒,仅LBBV出现明亮特异性条带,在304个样品中,第1轮PCR检出阳性样品14株,检出率为4.60％,巢式RT-PCR检出阳性样品28株,检出率为9.21％;本实验建立的巢式RT-PCR检测方法灵敏度高且特异性好,可用于LBBV的早期检测及防控.
Author 李宁求
梁红茹
刘礼辉
罗霞
付小哲
罗明菊
牛银杰
林强
AuthorAffiliation 上海海洋大学水产与生命学院,上海 201306;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业农村部渔用药物创制重点实验室,广东省水产动物免疫技术重点实验室,广东 广州 510380%中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业农村部渔用药物创制重点实验室,广东省水产动物免疫技术重点实验室,广东 广州 510380
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