鳗鲡疱疹病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用 - 李英英; 杨金先; 陈曦; 陈强; 宋铁英; 葛均青 (水产学报, 2021)
S941.41; 为了建立鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,利用PCR扩增出AngHV ORF49的序列,克隆至pET-32a载体,构建重组质粒pET-32a-ORF49,作为qPCR的标准品;根据ORF49序列设计引物,以梯度稀释的质粒标准品为模板,进行SYBR Green Ⅰ qPCR扩增,制作标准曲线,建立AngHV的qPCR检测方法,并评价其灵敏性、特异性、重复性和应用效果.结果 显示,qPCR的阈值循环数(cycle threshold value,CT)与标准品的拷贝数线性关系良好,且线性范围广,获得的标准曲线相关系数(R2)达到0.999,扩增效率为100.855％;该方法特异性好,可特异性检测AngHV,而对鲤疱疹病毒Ⅲ型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)、蛙虹彩病毒(Rana grylio virus,RGV)和鳗鲡虹彩病毒(Eel iridovirus,EIV)无扩增;该方法重复性强,组内和组间变异系数分别小于1％和2％;该方法灵敏性高于普通PCR法,最低可检测到10个病毒拷贝,而普通PCR法为1000个病毒拷贝.qPCR检测发现,在感染AngHV的欧洲鳗鲡主要组织内均可检测到AngHV,并且鳃、鳍和皮肤黏液内的病毒量显著高于其他组织;对保存的25份疑似鳗鲡"脱黏败血综合征"病料进行检测,阳性检出率为96％,而普通PCR法的阳性检出率仅为76％.本研究建立的AngHV SYBR GreenⅠ qPCR检测方法灵敏性高、特异性强、重复性好,可用于AngHV的快速和定量检测,对鳗鲡"脱黏败血综合征"的防控也具有重要意义.