基于微滴数字PCR技术建立HBV共价闭合环状DNA的检测方法 - 田原; 徐玲; 范子豪; 曹亚玲; 张向颖; 陈煜; 段钟平; 任锋 (Linchuang gandanbing zazhi, 2021)
目的 建立一种用于检测HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)的微滴数字PCR(ddPCR)方法。 方法 构建HBV cccDNA标准品，利用HBV cccDNA和松弛环状DNA(rcDNA)在结构上存在的差异，设计HBV cccDNA引物和探针，通过扩增HBV质粒得到HBV cccDNA标准品，把梯度稀释后的标准品作为HBV cccDNA检测的模板，建立ddPCR检测方法，并分析此方法的检出限和重复性；收集2017年6月—2020年10月在首都医科大学附属北京佑安医院就诊的20例临床患者的肝组织样本，均诊断为HBV感染，提取样本的DNA，利用质粒安全性ATP依赖的DNA酶(PSAD)进行酶切，得到HBV cccDNA模板，对ddPCR检测方法进行临床样本的评价，并与实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法作对比。计数资料两组间比较采用χ2检验。 结果 建立了基于ddPCR的HBV cccDNA检测方法，梯度稀释的HBV cccDNA标准品均能准确检出，检出限为1拷贝/μl，其中1×103、1×102、1×101拷贝/μl标准品的变异系数分别为4.41%、3.98%、5.09%；检测20例临床HBV患者样本的HBV cccDNA，ddPCR检测方法能检出17例，阳性率为85%，qPCR检测方法能检出11例，阳性率为55%，两组比较差异有统计学意义(χ2=4.286，P=0.038)。 结论 建立的ddPCR检测HBV cccDNA方法具有较低的检出限和较好的重复性，为进一步的临床检测提供了有效的工具。