光−電子相関顕微鏡法：蛍光タンパク質標識した細胞小器官を走査電子顕微鏡で捉える
光−電子相関顕微鏡法（Correlative light and electron microscopy: CLEM法）とは，同一試料を光学顕微鏡と電子顕微鏡を用いて観察し，両顕微鏡により得られた像の相関を得る解析法である．これまでに様々なCLEM法が開発され報告されているが，主に動物の培養細胞等が用いられており，植物の組織や細胞に適した方法は報告例は乏しい．植物組織・細胞においても，GFP等の蛍光で標識した生体分子の局在を高分解能で正確に捉えるためにはCLEM法の開発が重要である．我々は植物材料において，GFP蛍光を放つ細胞小器官の超微形態を高分解能走査電子顕微鏡で可視化する「GFP-走査電...
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| Published in | PLANT MORPHOLOGY Vol. 28; no. 1; pp. 15 - 21 |
|---|---|
| Main Author | |
| Format | Journal Article |
| Language | Japanese |
| Published |
日本植物形態学会
2016
|
| Subjects | |
| Online Access | Get full text |
| ISSN | 0918-9726 1884-4154 |
| DOI | 10.5685/plmorphol.28.15 |
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| Abstract | 光−電子相関顕微鏡法（Correlative light and electron microscopy: CLEM法）とは，同一試料を光学顕微鏡と電子顕微鏡を用いて観察し，両顕微鏡により得られた像の相関を得る解析法である．これまでに様々なCLEM法が開発され報告されているが，主に動物の培養細胞等が用いられており，植物の組織や細胞に適した方法は報告例は乏しい．植物組織・細胞においても，GFP等の蛍光で標識した生体分子の局在を高分解能で正確に捉えるためにはCLEM法の開発が重要である．我々は植物材料において，GFP蛍光を放つ細胞小器官の超微形態を高分解能走査電子顕微鏡で可視化する「GFP-走査電子相関顕微鏡法」の開発を進めている．細胞小器官をGFPで標識したシロイヌナズナ形質転換体の根端や子葉などの組織・器官を固定・脱水後，樹脂包埋する．そして，ミクロトームにより準超薄切し，導電性スライドガラスに載せ，そのGFP蛍光を共焦点レーザー顕微鏡により検出する．その後，その切片を電子染色し，高感度な反射電子検出器をもつ電界放出形走査電子顕微鏡により，蛍光を撮影した同一箇所の微細構造を撮影する．最後に，蛍光像と電顕像を重ね合わせることで，蛍光を放つオルガネラを特定し，その超微細構造を明らかにする．本技術は，蛍光タンパク質が普及した植物科学分野の超微細構造解析研究に大きく貢献できると期待される． |
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| AbstractList | 光−電子相関顕微鏡法（Correlative light and electron microscopy: CLEM法）とは，同一試料を光学顕微鏡と電子顕微鏡を用いて観察し，両顕微鏡により得られた像の相関を得る解析法である．これまでに様々なCLEM法が開発され報告されているが，主に動物の培養細胞等が用いられており，植物の組織や細胞に適した方法は報告例は乏しい．植物組織・細胞においても，GFP等の蛍光で標識した生体分子の局在を高分解能で正確に捉えるためにはCLEM法の開発が重要である．我々は植物材料において，GFP蛍光を放つ細胞小器官の超微形態を高分解能走査電子顕微鏡で可視化する「GFP-走査電子相関顕微鏡法」の開発を進めている．細胞小器官をGFPで標識したシロイヌナズナ形質転換体の根端や子葉などの組織・器官を固定・脱水後，樹脂包埋する．そして，ミクロトームにより準超薄切し，導電性スライドガラスに載せ，そのGFP蛍光を共焦点レーザー顕微鏡により検出する．その後，その切片を電子染色し，高感度な反射電子検出器をもつ電界放出形走査電子顕微鏡により，蛍光を撮影した同一箇所の微細構造を撮影する．最後に，蛍光像と電顕像を重ね合わせることで，蛍光を放つオルガネラを特定し，その超微細構造を明らかにする．本技術は，蛍光タンパク質が普及した植物科学分野の超微細構造解析研究に大きく貢献できると期待される． |
| Author | 豊岡, 公徳 |
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| Copyright | 2016 日本植物形態学会 |
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| Discipline | Botany |
| EISSN | 1884-4154 |
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| ISSN | 0918-9726 |
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| Issue | 1 |
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| PublicationCentury | 2000 |
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| PublicationTitle | PLANT MORPHOLOGY |
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| Publisher | 日本植物形態学会 |
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| References | Bell, K., Mitchell, S., Paultre, D., Posch, M., and Oparka, K. (2013) Correlative imaging of fluorescent proteins in resin-embedded plant material. Plant Physiol 161: 1595-1603. 豊岡公徳，佐藤繭子，朽名夏麿，永田典子 （2014） 高圧凍結技法を取り入れた広域透過電顕像自動取得システムの開発とその応用．Plant Morphol 26: 3-8. 花坂智人，松浦絵里，小笠原勝利，石田欣二 （2015） 走査電子顕微鏡による反射電子像観察―複数試料観察の効率化を目指して―. 医生電顕技術誌 28: 88. Grabenbauer, M. (2012) Correlative light and electron microscopy of GFP. Methods Cell Biol 111: 117-138. Toyooka, K., Sato, M., Kutsuna, N., Higaki, T., Sawaki, F., Wakazaki, M., Goto, Y., Hasezawa, S., Nagata, N., and Matsuoka, K. (2014) Wide-range high-resolution transmission electron microscopy reveals morphological and distributional changes of endomembrane compartments during log to stationary transition of growth phase in tobacco BY-2 cells. Plant Cell Physiol 55: 1544-1555. Furuta, K. M., Yadav, S. R., Lehesranta, S., Belevich, I., Miyashima, S., Heo, J. O., Vaten, A., Lindgren, O., De Rybel, B., Van Isterdael, G., Somervuo, P., Lichtenberger, R., Rocha, R., Thitamadee, S., Tahtiharju, S., Auvinen, P., Beeckman, T., Jokitalo, E., and Helariutta, Y. (2014) Plant development. Arabidopsis NAC45/86 direct sieve element morphogenesis culminating in enucleation. Science 345: 933-937. Toyooka, K., Goto, Y., Asatsuma, S., Koizumi, M., Mitsui, T., and Matsuoka, K. (2009) A mobile secretory vesicle cluster involved in mass transport from the Golgi to the plant cell exterior. Plant Cell 21: 1212-1229. Lidke, D. S., and Lidke, K. A. (2012) Advances in high-resolution imaging―techniques for three-dimensional imaging of cellular structures. J Cell Sci 125: 2571-2580. Toyooka, K. and Kang, B. H. (2014) Reconstructing plant cells in 3D by serial section electron tomography. Methods Mol Biol 1080: 159-170. Razi, M. and Tooze, S. A. (2009) Correlative light and electron microscopy. Methods Enzymol 452: 261-275. Haraguchi, T., Osakada, H., and Koujin, T. (2015) Live CLEM imaging to analyze nuclear structures at high resolution. Methods Mol Biol 1262: 89-103. Xiong, H., Zhou, Z., Zhu, M., Lv, X., Li, A., Li, S., Li, L., Yang, T., Wang, S., Yang, Z., Xu, T., Luo, Q., Gong, H., and Zeng, S. (2014) Chemical reactivation of quenched fluorescent protein molecules enables resin-embedded fluorescence microimaging. Nat Commun 5: 3992. Kuroiwa, T., Kawazu, T., Uchida, H., Ohta, T., and Kuroiwa, H. (1993) Direct evidence of plastid DNA and mitochondrial DNA in sperm cells in relation to biparental inheritance of organelle DNA in Pelargonium zonale by fluorescence/electron microscopy. Eur J Cell Biol 62: 307-313. Muller-Reichert, T. and Verkade, P. (2014) Preface. Correlative light and electron microscopy II. Methods Cell Biol 124: xvii-xviii. Gaietta, G., Deerinck, T. J., Adams, S. R., Bouwer, J., Tour, O., Laird, D. W., Sosinsky, G. E., Tsien, R. Y., and Ellisman, M. H. (2002) Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science 296: 503-507. 黒岩晴子（1991） 植物の胚発生研究へのテクノビット包埋技術の応用．Plant Morphol 3: 43-47. Mano, S., Nakamori, C., Kondo, M., Hayashi, M., and Nishimura, M. (2004) An Arabidopsis dynamin-related protein, DRP3A, controls both peroxisomal and mitochondrial division. Plant J 38: 487-498. Powell, R. D., Halsey, C. M., and Hainfeld, J. F. (1998) Combined fluorescent and gold immunoprobes: reagents and methods for correlative light and electron microscopy. Microsc Res Tech 42: 2-12. Peddie, C. J., Blight, K., Wilson, E., Melia, C., Marrison, J., Carzaniga, R., Domart, M. C., O’Toole, P., Larijani, B., and Collinson, L. M. (2014) Correlative and integrated light and electron microscopy of in-resin GFP fluorescence, used to localise diacylglycerol in mammalian cells. Ultramicroscopy 143: 3-14. Jahn, K. A., Barton, D. A., Kobayashi, K., Ratinac, K. R., Overall, R. L., and Braet, F. (2012) Correlative microscopy: providing new understanding in the biomedical and plant sciences. Micron 43: 565- 582. |
| References_xml | – reference: Toyooka, K., Goto, Y., Asatsuma, S., Koizumi, M., Mitsui, T., and Matsuoka, K. (2009) A mobile secretory vesicle cluster involved in mass transport from the Golgi to the plant cell exterior. Plant Cell 21: 1212-1229. – reference: 花坂智人，松浦絵里，小笠原勝利，石田欣二 （2015） 走査電子顕微鏡による反射電子像観察―複数試料観察の効率化を目指して―. 医生電顕技術誌 28: 88. – reference: Lidke, D. S., and Lidke, K. A. (2012) Advances in high-resolution imaging―techniques for three-dimensional imaging of cellular structures. J Cell Sci 125: 2571-2580. – reference: Muller-Reichert, T. and Verkade, P. (2014) Preface. Correlative light and electron microscopy II. Methods Cell Biol 124: xvii-xviii. – reference: 黒岩晴子（1991） 植物の胚発生研究へのテクノビット包埋技術の応用．Plant Morphol 3: 43-47. – reference: Xiong, H., Zhou, Z., Zhu, M., Lv, X., Li, A., Li, S., Li, L., Yang, T., Wang, S., Yang, Z., Xu, T., Luo, Q., Gong, H., and Zeng, S. (2014) Chemical reactivation of quenched fluorescent protein molecules enables resin-embedded fluorescence microimaging. Nat Commun 5: 3992. – reference: Kuroiwa, T., Kawazu, T., Uchida, H., Ohta, T., and Kuroiwa, H. (1993) Direct evidence of plastid DNA and mitochondrial DNA in sperm cells in relation to biparental inheritance of organelle DNA in Pelargonium zonale by fluorescence/electron microscopy. Eur J Cell Biol 62: 307-313. – reference: Bell, K., Mitchell, S., Paultre, D., Posch, M., and Oparka, K. (2013) Correlative imaging of fluorescent proteins in resin-embedded plant material. Plant Physiol 161: 1595-1603. – reference: Peddie, C. J., Blight, K., Wilson, E., Melia, C., Marrison, J., Carzaniga, R., Domart, M. C., O’Toole, P., Larijani, B., and Collinson, L. M. (2014) Correlative and integrated light and electron microscopy of in-resin GFP fluorescence, used to localise diacylglycerol in mammalian cells. Ultramicroscopy 143: 3-14. – reference: Haraguchi, T., Osakada, H., and Koujin, T. (2015) Live CLEM imaging to analyze nuclear structures at high resolution. Methods Mol Biol 1262: 89-103. – reference: Jahn, K. A., Barton, D. A., Kobayashi, K., Ratinac, K. R., Overall, R. L., and Braet, F. (2012) Correlative microscopy: providing new understanding in the biomedical and plant sciences. Micron 43: 565- 582. – reference: Razi, M. and Tooze, S. A. (2009) Correlative light and electron microscopy. Methods Enzymol 452: 261-275. – reference: Grabenbauer, M. (2012) Correlative light and electron microscopy of GFP. Methods Cell Biol 111: 117-138. – reference: Powell, R. D., Halsey, C. M., and Hainfeld, J. F. (1998) Combined fluorescent and gold immunoprobes: reagents and methods for correlative light and electron microscopy. Microsc Res Tech 42: 2-12. – reference: Furuta, K. M., Yadav, S. R., Lehesranta, S., Belevich, I., Miyashima, S., Heo, J. O., Vaten, A., Lindgren, O., De Rybel, B., Van Isterdael, G., Somervuo, P., Lichtenberger, R., Rocha, R., Thitamadee, S., Tahtiharju, S., Auvinen, P., Beeckman, T., Jokitalo, E., and Helariutta, Y. (2014) Plant development. Arabidopsis NAC45/86 direct sieve element morphogenesis culminating in enucleation. Science 345: 933-937. – reference: Mano, S., Nakamori, C., Kondo, M., Hayashi, M., and Nishimura, M. (2004) An Arabidopsis dynamin-related protein, DRP3A, controls both peroxisomal and mitochondrial division. Plant J 38: 487-498. – reference: 豊岡公徳，佐藤繭子，朽名夏麿，永田典子 （2014） 高圧凍結技法を取り入れた広域透過電顕像自動取得システムの開発とその応用．Plant Morphol 26: 3-8. – reference: Gaietta, G., Deerinck, T. J., Adams, S. R., Bouwer, J., Tour, O., Laird, D. W., Sosinsky, G. E., Tsien, R. Y., and Ellisman, M. H. (2002) Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science 296: 503-507. – reference: Toyooka, K. and Kang, B. H. (2014) Reconstructing plant cells in 3D by serial section electron tomography. Methods Mol Biol 1080: 159-170. – reference: Toyooka, K., Sato, M., Kutsuna, N., Higaki, T., Sawaki, F., Wakazaki, M., Goto, Y., Hasezawa, S., Nagata, N., and Matsuoka, K. (2014) Wide-range high-resolution transmission electron microscopy reveals morphological and distributional changes of endomembrane compartments during log to stationary transition of growth phase in tobacco BY-2 cells. Plant Cell Physiol 55: 1544-1555. |
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| SourceType | Publisher |
| StartPage | 15 |
| SubjectTerms | correlative light and electron microscopy GFP peroxisome scanning electron microscope |
| Title | 光−電子相関顕微鏡法：蛍光タンパク質標識した細胞小器官を走査電子顕微鏡で捉える |
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| Volume | 28 |
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| ispartofPNX | PLANT MORPHOLOGY, 2016, Vol.28(1), pp.15-21 |
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