棉铃虫酯酶突变体的构建、表达及酶促动力学特性

在前期研究的基础上,基于定点突变技术在棉铃虫酯酶001F和001G的A127位和F238位分别人工构建由丙氨酸（A）变为天冬氨酸（D）、苯丙氨酸（F）变为亮氨酸（L）的单、双位点突变体,利用杆状病毒载体表达系统对其进行异源真核表达,采用酶标仪测定表达产物对α-乙酸萘酯和4-硝基苯基乙酸酯的酶促动力学参数.结果表明：酯酶A127位突变降低了酯酶的酶促水解活性,其对底物的亲和力明显减弱（反应常数Km值变大）,速率常数kcat/Km值仅为突变前的1/20～1/90；F238位突变对酯酶的酶促水解作用影响相对较小,其kcat/Km值为突变前的1/2～1/7；双位点突变体（A127D/F238L）几乎全...

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Published in浙江大学学报（农业与生命科学版） Vol. 40; no. 1; pp. 16 - 24
Main Author 李永强 吴美玲 马志卿 冯俊涛 张兴
Format Journal Article
LanguageChinese
Published 西北农林科技大学无公害农药研究服务中心，陕西 杨凌712100 2014
西北农林科技大学植物保护学院，陕西 杨凌712100
Subjects
4-硝基苯基乙酸酯
α-乙酸萘酯
氨基酸突变
酯酶
酶促动力学
氨基酸突变
4-硝基苯基乙酸酯
酯酶
amino acid mutations
酶促动力学
α-naphthyl acetate
enzymatic kinetics
carboxylesterases
para-nitrophenyl acetate
α-乙酸萘酯
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ISSN1008-9209
DOI10.3785/j.issn.1008-9209.2012.04.062

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Summary:在前期研究的基础上,基于定点突变技术在棉铃虫酯酶001F和001G的A127位和F238位分别人工构建由丙氨酸（A）变为天冬氨酸（D）、苯丙氨酸（F）变为亮氨酸（L）的单、双位点突变体,利用杆状病毒载体表达系统对其进行异源真核表达,采用酶标仪测定表达产物对α-乙酸萘酯和4-硝基苯基乙酸酯的酶促动力学参数.结果表明：酯酶A127位突变降低了酯酶的酶促水解活性,其对底物的亲和力明显减弱（反应常数Km值变大）,速率常数kcat/Km值仅为突变前的1/20～1/90；F238位突变对酯酶的酶促水解作用影响相对较小,其kcat/Km值为突变前的1/2～1/7；双位点突变体（A127D/F238L）几乎全部失去了对底物的酶促水解活性,其亲和力明显下降（Km值升高至突变前的4～30倍）, kcat/Km值为0.09～0.33μmol^-1. s^-1. L,仅为突变前的1/70～1/370.表明突变对酯酶活性有明显影响, A127位和F238位氨基酸残基是与酶催化功能相关的重要位点,这将为研究酯酶在棉铃虫代谢抗性中的作用提供一定的参考.
Bibliography:The cotton bollworm , Helicoverpa armigera （ Hubner）,is a major pest of many agricultural crops around the world , and many of the classes of chemical insecticides are widely used for its control such as organophosphates （ OPs） , synthetic pyrethroids （ SPs） , and so on . Currently H .armigera has developed serious resistance to OPs and SPs all over the world . Carboxylesterases （ CarEs） are a multi-gene family of enzymes that hydrolyze a diverse range of carboxylesters and are frequently implicated in the resistance of insects . Gene mutations of CarEs are a major mechanism of insects for the development of resistance to OPs in the OP-resistant Diptera pests like Musca domestica and Lucilia cuprina . It involves the substitution of a single amino acid within the active site of the esterase which convert it to an OP hydrolyase . However , no resembled mutation in nature was reported in the Lepidopterapestslikecottonbollworm,H.armigeratodate.Hence,followingourpreviousstudiestheaimofthe current work was to eluc
ISSN:1008-9209
DOI:10.3785/j.issn.1008-9209.2012.04.062