桂糖11号Rubisco基因克隆、原核表达及纯化

• Published in: 南方农业学报 Vol. 47; no. 4; pp. 524 - 529
• Main Author: 吴朝兴 蒋媛 王露蓉 顾彩彩 牛俊奇 孙波 李杨瑞 杨丽涛
• Format: Journal Article
• Language: Chinese
• Published: 广西农业科学院甘蔗研究所/中国农业科学院甘蔗研究中心/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室/广西甘蔗遗传改良重点实验室,南宁530007 2016; 广西大学农学院/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,南宁,530005%玉林师范学院生命科学与技术学院,广西玉林,537000%广西大学农学院/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,南宁530005
• Subjects: 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）; 克隆; 原核表达; 甘蔗; 纯化; 融合蛋白; 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco); 甘蔗; 克隆; fusion protein; 原核表达; purification; 融合蛋白; 纯化; ribulose-1,5-bisphosphosphate carboxylase/oxygenase (rubisco); clone; prokaryotic expression; sugarcane
• ISSN: 2095-1191
• DOI: 10.3969/j:issn.2095-1191.2016.04.524

【目的】通过原核表达及纯化获得甘蔗1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）的大、小亚基融合蛋白,为获得符合抗体制备条件的高纯度融合蛋白提供技术支持。【方法】以甘蔗品种桂糖11号（GT11）＋1叶为材料,根据NCBI公布的甘蔗Rubisco大、小亚基基因（rbc L和rbc S）的编码域序列（CDS）设计特异性引物,PCR扩增rbc L和rbc S基因的CDS,然后连接至原核表达载体p ET-30a（＋）,构建重组质粒后转入原核细胞（大肠杆菌Rosetta）中诱导表达,用镍亲和层析柱对融合蛋白进行纯化,并比较分析桂糖11号与其他甘蔗品种在rbc L和rbc S基因的CDS及编码蛋白序列方面的差异。【结果】rbc L和rbc S基因的CDS长度分别为1431和510 bp,其中桂糖11号rbc L基因的CDS与Saccharum hybrid cultivar SP80-3280（Gen Bank登录号AE009947）、Saccharum hybrid cultivar Q155（Gen Bank登录号KU214867）的一致,桂糖11号rbc S基因的CDS与Saccharum hybrid cultivar GT28（Gen Bank登录号JN591757）的存在7个碱基差异,但仅有2个氨基酸发生错义突变。Rbc L和Rbc S融合蛋白以包涵体形式存在原核细胞中,用镍离子亲和层析纯化及超滤浓缩后其浓度均在1.0 mg/m L以上。【结论】从桂糖11号成功克隆Rubisco大亚基和小亚基基因的CDS,大亚基基因的CDS比小亚基的保守性更高,且均可在原核细胞中高度表达,经纯化浓缩获得的高纯度融合蛋白可用于制备Rubisco单克隆抗体。