小鼠AFPcDNA真核表达载体的构建、表达及体外抗肝癌免疫活性的检测 - 曾斌 卢放根 刘小伟 羊东晔 方唯意 王健 廖爱军 石巍 (Ai zheng, 2005)
背景与目的：探索肝癌细胞的突变基因产物——具有潜在抗原性的异常蛋白质而无法形成有效免疫原的机理，寻找肝癌的特异性抗原．并在此基础上研制出治疗肝癌的DNA疫苗将对肝癌的免疫学治疗产生积极的影响。本实验构建BALB／c小鼠具有分泌性信号肽的AFP1 cDNA和去掉信号肽的AFP2cDNA真核表达载体，分别在小鼠树突细胞（dendritic cells，DCs）中表达．并观察其在体外抗肝癌免疫中的作用。方法：采用RT—PCR方法自小鼠肝癌细胞株H22中扩增出具有分泌性信号肽的AFP、cDNA和去掉分泌性信号肽的AFP2cDNA．将该基因定向插入真核表达载体PEGF—N3中：同时培养经rmGM—CSF、rmIL-4诱导的小鼠骨髓细胞，体外获取大量DCs，脂质体转染PEGF—N3／AFP1、PEGF—N3／AFP2至DCs进行表达、鉴定。将DCs疫苗与同源小鼠脾淋巴细胞混合培养，ELISA方法测定脾细胞γ-干扰素（IFN-γ）分泌活性，^51Cr释放法测定脾淋巴细胞的特异性杀伤活性。结果：从H22中克隆到AFP1 cDNA和AFP2 cDNA，经测序完全正确．所构建的真核表达质粒PEGF—N3／AFP．和PEGF—N3／AFP2在小鼠DCs中获得稳定高效表达，其中PEGF—N3／AFP2明显刺激T细胞增殖，刺激指数（SI）为5．12±1．46．明显高于空质粒组（1．42±0．73）。AFP2／DC疫苗对H22细胞的特异性杀伤活性[（88．15±16．47）％]明显高于空质粒组[（12．72±5．45）％]。结论：成功地构建了真核表达载体PEGF—N3／AFP1和PEGF—N3／AFP2，编码去掉分泌性信号肽的PEGF—N3／AFP2转染的DC，能够诱导较强的特异性抗肝癌免疫效应。其机制可能为诱导肝癌细胞凋亡。